Chromatogramme richtig integrieren und bewerten

Ein Praxishandbuch für die HPLC und GC

Stavros Kromidas, Hans -Joachim Kuss

• Verlag: Wiley-VCH
• Jahr: 2012
• ISBN:
  9783527660155
• Auflage: 1
• Thema: Physical Sciences
• Thema: Analytic Chemistry

Stavros Kromidas und Hans-Joachim Kuss schließen mit ihrem Autorenteam aus erfahrenen Experten eine wichtige Lücke in der Analytik-Literatur: Sie stellen prägnant und nachvollziehbar den Weg von den Rohdaten zum bewerteten Ergebnis vor. Das ist besonders wichtig für gesetzlich relevante Messungen, z. B. in der Pharma- und Nahrungsmittelanalytik, denn wer hier Fehler macht, erzeugt trotz korrekter Messdaten falsche Informationen. Und auf die gebräuchlichen Auswerteprogramme ist nicht immer Verlass.

Teil I

Auswertung in der Chromatographie – die Integration

1

Das Chromatogramm

Daniel Stauffer

1.1 Chromatographischer Prozess

Eine chromatographische Trennung ist dann erfolgreich, wenn es gelingt, die einzelnen Komponenten des zu trennenden Gemischs unterschiedlich schnell durch die Trennstrecke (stationäre Phase) wandern zu lassen. Die Möglichkeiten, unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten der einzelnen Analyten zu realisieren, lassen sich in zwei Gruppen aufteilen:

1. Die Retention erfolgt durch unterschiedlich starke Sorption des Analyten an die stationäre Phase = unterschiedliche absolute Wanderungsgeschwindigkeit (z. B. Normalphasen-/Umkehrphasenchromatographie, Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie).

2. Die poröse stationäre Phase teilt unterschiedlich großen Analytenteilchen unterschiedlich große Räume innerhalb der Trennstrecke zu, in welchen sie sich aufhalten können. Moleküle welche so groß sind, dass sie sich nur im Zwischenkornvolumen und somit im strömenden Eluenten aufhalten können, wandern am schnellsten. Weil die Wanderungsgeschwindigkeit für alle diese Teilchen ungefähr gleich groß ist, werden sie nicht getrennt. Kleinere Moleküle können durch Diffusion zusätzlich in die Poren der stationären Phase gelangen. In den Poren steht der Eluent. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Analytenteilchen in Flussrichtung ist somit während ihres Aufenthaltes im Porenvolumen der stationären Phase gleich null. Je kleiner die Analytenmoleküle sind, umso größer ist das für sie zugängliche Porenvolumen und somit die Aufenthaltszeit im stehenden Eluenten. Daraus resultieren für unterschiedlich große Moleküle unterschiedlich lange Wanderungswege = unterschiedliche relative Wanderungsgeschwindigkeit. Größenausschlusschromatographie (Size Exclusion Chromatography, SEC), Gelpermeationschromatographie (GPC) und Gelfiltrationschromatographie (GFC) sind die gängigsten Bezeichnungen für diese Art von Chromatographie.

Die Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen Analyten kann durch Verändern verschiedener Einflussgrößen wie Zusammensetzung der mobilen Phase, Art der stationären Phase, Temperatur etc. mehr oder weniger kontinuierlich verändert werden. Man kann von einer analogen¹⁾ Chromatographie sprechen. Quantifizierung mittels Chromatographie erfolgt in der Regel auf diese Art.

Bei der Chromatographie mittels Sorption können die chromatographischen Bedingungen im Idealfall so gewählt werden, dass nur eine Komponente wandert und die anderen Komponenten am Kopf der Trennstrecke total festgehalten werden resp. dass nur eine Komponente festgehalten wird und die andern Komponenten wandern. Die am Säulenkopf festgehaltenen Moleküle werden anschließend durch Änderung der chromatographischen Bedingungen zum Wandern gebracht. Diese, hauptsächlich in der präparativen Chromatographie angewendete, Methode wird oft als digitale¹⁾ Chromatographie bezeichnet.

1.1.1 Selektivität und Effizienz – Maß für die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit

In der Chromatographie müssen wir zwischen zwei Arten von unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten unterscheiden. Gewünscht ist, dass unterschiedliche Spezies von Molekülen unterschiedlich schnell wandern. Das führt schlussendlich zur Trennung der einzelnen Komponenten. Je größer der Unterschied der Wanderungsgeschwindigkeit der unterschiedlichen Komponenten, umso besser ist die Trennung. Das System besitzt eine gute Selektivität (s. Abb. 1.1 und 1.8).

Auf der andern Seite haben auch die gleichartigen Moleküle leicht unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten. Dieser unerwünschte Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit wird als Effizienz (s. Abb. 1.2) des chromatographischen Systems bezeichnet. Kleine Unterschiede in der Wanderungsgeschwindigkeit gleichartiger Moleküle = schmale Peaks = gute Effizienz = große theoretische Bodenzahl (s. Gl. 1.9).

Abb. 1.1 Unterschiedliche Arten von Molekülen wandern unterschiedlich schnell. Dieser gewünschte Unterschied der Wanderungsgeschwindigkeiten wird als Selektivität des chromatographischen Systems bezeichnet.

Abb. 1.2 Auch gleichartige Moleküle haben infolge von Eddy-Diffusion, Längsdiffusion und Massenaustauschverzögerung leicht unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten, was zu Bandenverbreiterung führt (= Effizienz des chromatographischen Systems).

1.2 Chromatographische Kenngrößen

Bei analytischen Anwendungen ist der Zweck der Chromatographie, ein Chromatogramm zu erhalten, welches uns alle gewünschten Informationen liefert [1].

1.2.1 Retentionsgrößen

Diese bieten uns die Möglichkeit, Aussagen über die Art einer Probekomponente zu machen.

Normalerweise werden Retentionszeiten verwendet; an Stelle der Retentionszeit wird oft auch das Retentionsvolumen verwendet, weil dieses vom Eluentenfluss unabhängig ist.

(1.1)

mit:

V_R = Retentionsvolumen, t_R = Retentionszeit, F = Eluentenfluss.

Retentionsgrößen werden im Chromatogramm immer dort bestimmt, wo die höchste Probenkonzentration gemessen wird; also bei der Peakspitze.

1.2.1.1 Totzeit (t_m; t₀)

Unter Totzeit versteht man die Zeit, welche ein nicht-retardiertes Teilchen braucht, um die Trennstrecke zu durchqueren. Während dieser Zeit halten sich alle Probeteilchen in der mobilen Phase auf. Die genaue Bestimmung der Totzeit ist nicht so einfach; für die meisten Zwecke genügt es, die Totzeit mit einem sog. „Totzeitmarker“ zu messen (z. B. Methan in der GC resp. Nitromethan, Thioharnstoff, Uracil oder KNO₃ in der LC). Genauer erhält man die Totzeit durch Berechnung aus den Bruttoretentionszeiten von mindestens drei homologen Verbindungen, weil log k von Homologen in linearer Abhängigkeit zu deren Molmassen steht [9].

1.2.1.2 Bruttoretentionszeit (t_ms; t_R)

Als Bruttoretentionszeit wird die durchschnittliche Zeit bezeichnet, welche ein Probeteilchen braucht um die Trennstrecke zu durchqueren. Die Bruttoretentionszeit setzt sich zusammen aus den Zeiten während welcher sich ein Probeteilchen in der mobilen und in (an) der stationären Phase aufgehalten hat. In Chromatogrammen werden die einzelnen Peaks in der Regel mit der Bruttoretentionszeit beschriftet.

Abb. 1.3 Totzeit und Brutto- resp. Nettoretentionszeit von Peak Nr. 3. t_m = Totzeit, t_s = Nettoretentionszeit, t_ms = Bruttoretentionszeit.

1.2.1.3 Nettoretentionszeit (t_s)

Die Nettoretentionszeit sagt aus, wie lange sich eine Probekomponente in (an) der stationären Phase aufgehalten hat.

(1.2)

mit:

t_m= Totzeit, t_s = Nettoretentionszeit, t_ms = Bruttoretentionszeit.

1.2.1.4 Retentionsfaktor oder Kapazitätsfaktor (k; k′)

Der Retentionsfaktor entspricht der Nettoretentionszeit, ausgedrückt in Anzahl Totzeiten. Als relative Retentionsgröße ist der k-Wert praktisch unabhängig vom Eluentenfluss und von den Säulendimensionen.

(1.3)

mit:

k = Retentionsfaktor, t_m = Totzeit, t_s = Nettoretentionszeit, t_ms = Bruttoretentionszeit.

1.2.2 Peak-Ausdehnung und Peakform

1.2.2.1 Basispeakbreite (w_b)

Die Basispeakbreite wird zwischen den Schnittpunkten der auf- und der absteigenden Wendetangente mit der Basislinie gemessen. Bei idealen chromatographischen Peaks (Gauß-Peaks) befindet sich die Basispeakbreite in 13,4% der Peakhöhe und entspricht der vierfachen Standardabweichung der Normalverteilung (s. Abb. 1.4).

Abb. 1.4 Die Basispeakbreite (w_b) und die Peakbreite in halber Höhe (b_0,5). Bei idealen Peaks befindet sich die Basispeakbreite in 13,4% der Peakhöhe.

Abb. 1.5 Die Peakhöhe wird von der Peakspitze bis zur Basislinie gemessen.

1.2.2.2 Peakbreite in halber Höhe (w_h)

Weil es nicht ganz einfach ist, die Basispeakbreite zu bestimmen, wird oft die Peakbreite in halber Höhe (Halbwertsbreite) in Berechnungen eingesetzt (selbstverständlich muss die Formel entsprechend korrigiert werden).

1.2.2.3 Peakhöhe (h)

Die Peakhöhe ist die Ausdehnung des Peaks, von der Peakspitze bis zum Schnittpunkt mit der Basislinie (senkrecht zur Zeitachse gemessen).

1.2.2.4 Peaksymmetrie, Tailingfaktor (T)

Der Symmetriefaktor eines Peaks sagt aus, wie gut seine Form der Idealform eines chromatographischen Peaks (Gauß’sche Glockenkurve) angenähert ist. Der Tailingfaktor wird in Europa meistens in 10% (manchmal auch 5% oder 15%) der Peakhöhe bestimmt (s. Gl. 1.4).

Abb. 1.6 Die Peaksymmetrie wird in 10% (5%) der Peakhöhe gemessen, wobei a die „halbe“ Peakbreite der aufsteigenden und b der absteigenden Peakseite bezeichnet.

Abb. 1.7 Peakleading und Peaktailing. In der Praxis kommt das Peaktailing viel öfter vor als das Leading. Aufgepasst: In vielen Publikationen findet man Chromatogramme, bei welchen die Zeitachse von links nach rechts verläuft, weil zur Aufzeichnung des Chromatogramms z. B. ein Kompensationsschreiber verwendet wurde.

(1.4)

mit:

T = Symmetrie- resp. Tailingfaktor, a = Breite der aufsteigenden Peakseite (in 0,1 h), b = Breite der absteigenden Peakseite (in 0,1 h).

Nach USP werden die Werte in 5% der Peakhöhe gemessen. Die Berechnung erfolgt nach folgender Formel:

(1.5)

mit:

T = Symmetrie- resp. Tailingfaktor, a = Breite der aufsteigenden Peakseite (in 0,05 h), b = Breite der absteigenden Peakseite (in 0,05 h).

Langsames Ansteigen und schnelles Abfallen des Peaksignals nennt man Leading oder Fronting. Das Umgekehrte, schneller Anstieg und langsames Abfallen, nennt man Tailing.

Symmetrischer Peak:	T = 1
Peaktailing:	T > 1
Peakleading:	T < 1

1.2.3 Auflösungsgrößen

1.2.3.1 Die Auflösung (R)

Die Auflösung ist ein Maß, wie gut zwei Komponenten voneinander getrennt sind. Als Auflösung wird das Verhältnis von Selektivität und Effizienz eines Systems bezeichnet. Sie sagt nichts darüber aus, wie breit die Peaks sind.

Unaufgelöste Peaks (Abb. 1.8 a) können getrennt werden durch:

• Vergrößern der Effizienz des Trennsystems (Abb. 1.8 b),
• Vergrößern der Selektivität (Abb. 1.8 c).

Abb. 1.8 Unaufgelöste Peaks (a) können getrennt werden durch: Vergrößern der Effizienz des Trennsystems (b) oder Vergrößern der Selektivität (c).

Selektivität = Maß für den Retentionsunterschied zweier Komponenten großer Retentionszeit-Unterschied = selektives System

Effizienz = Maß für die Peakverbreiterung einer Komponente schmale Peaks = effizientes System

Wenn man Gleichung (1.7) etwas näher betrachtet, lassen sich drei wichtige Aussagen ableiten:

1. Die Selektivität ist die empfindlichste Größe zur Beeinflussung der Auflösung [10].

2. Die Auflösung lässt sich zwar leicht durch Vergrößern der Bodenzahl, sprich Verlängern der Säule, erhöhen. Weil die Effizienz aber nur als

in die Gleichung ein...

Inhaltsverzeichnis

• Cover
• Series Page
• Title Page
• Copyright
• Vorwort
• Autorenliste
• Zum Aufbau des Buches
• Teil I: Auswertung in der Chromatographie – die Integration
• Teil II: Die Charakteristika der Auswertung in einzelnen LC-Modi
• Teil III: Anforderungen an und Umgang mit chromatographischen Daten aus Sicht von Organisationen und Behörden
• Stichwortverzeichnis