HPLC richtig optimiert

Ein Handbuch für Praktiker

Stavros Kromidas

• Verlag: Wiley-VCH
• Jahr: 2012
• ISBN:
  9783527660353
• Auflage: 1
• Thema: Naturwissenschaften
• Thema: Analytische Chemie

Neben der Methodenentwicklung ist die Optimierung bestehender Methoden eine zentrale Aufgabe im HPLC-Labor. Eine Aufgabe, die heute in immer kurzerer Zeit und kosteneffizient erledigt werden muss. Das Handbuch bietet eine fundierte Hilfe, um diese Herausforderung noch besser zu meistern.
International renommierte Autoren behandeln sowohl die allgemeinen Grundlagen und Strategien der Optimierung als auch die spezifischen Aspekte der unterschiedlichen Techniken wie RP-HPLC, NP-HPLC, Micro- und Nano-HPLC sowie der Kopplungstechniken wie LC-MS. Auch die richtige Saulenauswahl sowie Enantiomerentrennungen gehoren zu den behandelten Themen. Die Autoren liefern konkrete, praktische Tipps ebenso wie relevante Hintergrundinformationen. Sie bieten daruber hinaus Einblicke in die Optimierungspraxis sieben international renommierter Firmen verschiedener Branchen. Einige Beitrage stellen die Anwendung gangiger Optimierungssoftware wie DryLab oder ChromSword dar. Das ganze wird abgerundet durch praxisnahe Berichte erfahrener Anwender aus den verschiedenen Anwendungsgebieten, inbesondere aus den Life Sciences, wie beispielsweise Proteomics oder Pharmaentwicklung. Alle Beitrage sind in einem auf das Wesentliche konzentrierten und anwendungsnahen Stil geschrieben. Der Aufbau des Buches mit abgeschlossenen Kapiteln erleichtert das gezielte Nachschlagen.

1

Grundsätzliches zur Optimierung

1.1 Grundsätze der Optimierung in der HPLC am Beispiel der RP-Chromatographie

Stavros Kromidas

Zunächst werden einige Fragen diskutiert, die sinnvollerweise zu Beginn einer Methodenentwicklung zu klären sind. Anschließend wenden wir uns den prinzipiellen Möglichkeiten zur Verbesserung der Auflösung in der HPLC zu. Es folgt eine Diskussion über Effizienz und Abfolge der einzelnen Maßnahmen für den isokratischen und den Gradienten-Modus. Ein Schwerpunktthema der Ausführungen bilden Strategien und Konzepte zur Methodenentwicklung und Überprüfung der Peakhomogenität. Schließlich werden Wege zur Verfolgung weiterer Ziele als „besser trennen“ aufgezeigt: „schneller trennen“, „empfindlicher messen“, „Geld sparen“. Das Kapitel wird mit einer Zusammenfassung und einem Ausblick beendet.

1.1.1 Vor den ersten Optimierungsschritten

Es ist aus Gründen der Ökonomie sinnvoll, sich zu Beginn einer Methodenentwicklung/Trennungsoptimierung als erste Aktion mit folgenden Fragen zu befassen:

• Was will ich? Also: Was ist das eigentliche Ziel meiner Trennung?
• Was habe ich? Also: Über welche analytisch relevante Informationen bzgl. der Probe verfüge ich?
• Wie mache ich es? Also: Steht das, was ich bräuchte, zur Verfügung und ist das, was ich vorhabe, auch tatsächlich realisierbar?

Auch wenn auf den ersten Blick diese Fragen etwas (zu) theoretisch oder gar abgehoben erscheinen mögen, halte ich es für notwendig, zu Beginn eines Projekts die analytische Fragestellung und die realistischen Möglichkeiten zu deren Bewältigung bewusst wahrzunehmen. Ein frühes Gespräch mit meinem Chef, meinem Kollegen, meinem Kunden oder zur Not mit mir selbst kann späteren Ärger, Zeitvergeudung und letztendlich Kosten ersparen. Diese Zeit kann als eine sichere Investition angesehen werden.

Zur ersten Frage: Was will ich?

Wenn irgend möglich, sollten vor dem Start folgende oder ähnliche Fragen beantwortet werden:

• Brauche ich eine Methode, um diesen hochtoxischen Metaboliten auf jeden Fall zu quantifizieren, oder verfolge ich das Ziel, dass die Behörde meine Methode akzeptiert?
• Was ist im vorliegenden Fall wichtig: Schnelle Analysenzeiten, langlebige Säulen, robuste Bedingungen, oder steht im Vordergrund eine höchstmögliche Spezifität ohne Wenn und Aber?
• Warum darf der VK (VK: Variationskoeffizient) höchstens 2 % betragen? Um wie viel schlechter wird unser Produkt, wenn sich ein VK von 2,5 % ergeben würde? Gehen die Analysenkosten tatsächlich mit der Qualität des Produkts einher?

Es handelt sich, vereinfacht formuliert, um folgende Frage: Geht es im konkreten Fall um die Erfüllung von Anforderungen, oder geht es tatsächlich um „Wahrheit“, d. h., stehen formale Aspekte oder die analytische Fragestellung im Vordergrund? Diese Frage sollte wegen möglicher Konsequenzen bewusst und ehrlich beantwortet werden. Wie schwer es in unserer Zeit ist, zu sinnvollen und durchdachten Entscheidungen zu stehen, ohne als Exot oder gar als Querulant zu gelten, wurde an anderer Stelle beschrieben [1].

Wenn (!) das Umfeld es ermöglicht, sollte man sich darin üben, alles zu hinterfragen. Unkonventionelle Fragen führen häufig zu einfachen, vernünftigen Lösungswegen.

Zur zweiten Frage: Was habe ich?

Informationen über die Probe erleichtern die Entwicklung eines geeigneten Methodendesigns, z. B.:

• Was steht im Bericht der Kollegen aus der chemischen Entwicklung über Lichtempfindlichkeit und Sorptionsverhalten des neuen Wirkstoffs gegenüber Glasoberflächen? Kann ich schnell dort anrufen? Das heißt, komme ich mit einem vertretbaren Aufwand an relevante Informationen heran?
• Stehen in der internen Datenbank (die bedauerlicherweise selten gepflegt und noch seltener in Anspruch genommen wird) nicht doch Informationen über ähnliche Trennungen aus der Vergangenheit, die seinerzeit nicht weiterverfolgt wurden?
• Ich kann doch schnell über die bekannte Struktur der Hauptkomponente ihren pK_s-Wert ausrechnen und so beim geeigneten pH-Wert die ersten Versuche starten (s. Kap. 1.4). Die entsprechende Software hatten wir doch vor kurzem gekauft, oder wie war es? Wie sind die Erfahrungen des Kollegen Miller aus der Nachbarabteilung, der früher mit ähnlichen Substanzen zu tun hatte?

Wenn die Widerstände nicht allzu groß sind, sollte man das Mittel der Kommunikation und des Austauschs nutzen – wenn es sein muss, ohne darüber zu sprechen.

Zur dritten Frage: Wie mache ich es?

Man sollte die Machbarkeit eines Vorhabens unbedingt realistisch abschätzen, mögen sonstige Fakten und Argumente objektiv auch noch so „richtig“ sein, z. B.:

• Kann ich meinen Abteilungsleiter davon überzeugen, dass es aus Gesamt-Firmensicht sinnvoll wäre, im Vorfeld (!) mit den späteren Routineanwendern über Methodendesign und weitere Details der Methode zu sprechen? Wenn allerdings Angst um Know-How-Verlust oder Budgetfragen oder sonstige psychosoziale Barrieren ein Gespräch mit den „anderen“ de facto unmöglich machen, ist dies eine bittere, aber eine zu akzeptierende Realität. Oder: Ist es sinnvoll, um eine Änderung folgender allgemein bekannter und akzeptierter Situation zu kämpfen?: Ein Termin ist vorgegeben, also ist die Validierung in zwei Wochen durchzuziehen. Die späteren (immensen) Folgekosten durch Wiederholmessungen, Reklamationen usw., die unweigerlich dadurch entstehen, dass kaum eine analytische Methode unter realen Bedingungen in zwei Wochen zu validieren ist, belasten ja nicht „uns“, sondern die Qualitätskontrolle. Als Prüfkosten gehen sie unter und werden mangels nüchterner, ganzheitlicher Betrachtung sowieso seit Jahrzehnten in Kauf genommen. Die Konsequenzen, oder positiv formuliert, das Verbesserungspotenzial möge der Leser sich selbst ausmalen.
• Ist es bei der Entwicklung einer späteren Routinemethode, die weltweit eingesetzt werden soll, wirklich sinnvoll, sich unbedingt für eine polare RP-Phase ob ihrer häufig besseren Selektivität zu entscheiden, wo doch aller Voraussicht nach Probleme mit der Chargenreproduzierbarkeit zu erwarten sind? Ist möglicherweise eine hydrophobe, robustere Säule mit einer geringeren, aber durchaus ausreichenden Selektivität die bessere Alternative?
• Ist es sinnvoll, mein analytisches „Können“ unter Beweis zu stellen, indem ich den VK einer Methode, die später in diversen Betriebslabors eingesetzt werden soll, auf 0,7 % trimme?

Realitäten – und Meinungen sind auch Realitäten –, die über Erfolg und Misserfolg der analytischen Tätigkeit mitbestimmen, sollten, wenn irgend möglich, in das Methodendesign einfließen. So hilft es, wenn die Anzahl von Meetings zugunsten von „Kaffee-Runden“ und „Zusammen essen gehen“ herabgesetzt werden würde. Es gilt, die Kommunikation zu Lasten eines – in einer bestimmten Umgebung obligatorischen und erwarteten – „gekonnten“ Austauschs von Argumenten, „sich einbringen zu müssen“-Mentalität sowie der Darstellung von ohnehin bekannten Ansichten zu erhöhen.

Zusammenfassend wären für eine erfolgreiche Methodenentwicklung folgende zwei Grundvoraussetzungen zu nennen:

1. Fachliche Kompetenz ist vorhanden bzw. sie kann „ausgeliehen“ oder „eingekauft“ werden.

2. Die analytischen Möglichkeiten passen zu den Anforderungen, und man kann darüber sprechen.

Klares Definieren von Vorgaben, unmissverständlich formulierte, für alle Beteiligten nachvollziehbare Ziele, kurze Informationswege und kritisches Abschätzen von Möglichkeiten/Risiken sind meines Erachtens (nicht nur) in der Analytik wichtiger als das Erreichen von „Spitzen“-Werten, wie niedrige Nachweisgrenzen, Korrelationskoeffizienten um 0,999, VKs kleiner 1 % oder um 30 % günstigere Geräte.

1.1.2 Was heißt eigentlich „Optimierung“?

Bei den Bemühungen um Optimierung einer Trennung werden grundsätzlich folgende Ziele avisiert:

• besser trennen (bessere Auflösung),
• schneller trennen (kürzere Retentionszeit),
• „mehr“ sehen (niedrigere Nachweisgrenze),
• billiger trennen (Ökonomie anstreben),
• mehr trennen (größerer Durchsatz).

Die drei erstgenannten Ziele dürften die wichtigsten sein, und von diesen wiederum liegt die Verbesserung der Auflösung wahrscheinlich an erster Stelle. Wir werden uns daher zunächst und ausführlicher mit diesem Punkt beschäftigen, bevor wir uns den anderen Aspekten widmen. Die präparative HPLC ist nicht Gegenstand dieses Buches.

Vorbemerkungen

Die Theorie der Chromatographie gilt prinzipiell für alle chromatographischen Techniken. Demzufolge werden im Grundsatz stets die gleichen Optimierungsprinzipien verfolgt. Es liegt allerdings auf der Hand, dass die Prioritäten und die Gewichtung der einzelnen Maßnahmen beispielsweise in der GPC und in der μ-LC-MS(MS) doch recht unterschiedlich ausfallen. Nachfolgend werden Optimierungsmöglichkeiten aufgezeigt sowie in kompakter Form Vorschläge für die populärste der flüssigchromatographischen Techniken, der R...

Inhaltsverzeichnis

• Cover
• Series Page
• Title Page
• Copyright
• Vorwort
• Autorenverzeichnis
• Zum Aufbau des Buches
• 1: Grundsätzliches zur Optimierung
• 2: Die Charakteristika der Optimierung in einzelnen HPLC-Modi
• 3: Kopplungstechniken
• 4: Computer-unterstützte Optimierung
• 5: „Anwender berichten“
• Anhang
• Stichwortverzeichnis