Leitfaden für die Zell- und Gewebekultur

Einführung in Grundlagen und Techniken

Hans Jürgen Boxberger

• Verlag: Wiley-Blackwell
• Jahr: 2013
• ISBN:
  9783527661992
• Auflage: 1
• Thema: Biological Sciences
• Thema: Cell Biology

Nowadays cell culture is part of the tools used in all bio-professions, whether in research, industry or clinics. The author, the manager of a cell culture company, explains the main aspects in a clear and readily comprehensible manner.
An overview of the most important instruments, materials and nutrients, the basic rules of sterile working, as well as a description of the most common problems and how to solve them quickly equip trainees, students and specialists (again) for the cell laboratory.
Includes a glossary of all important technical terms.

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Geschichte und Bedeutung der Zellkultur

1.1 Das biologische Zeitalter

Leben wir im Zeitalter der Biologie? In seiner Neigung zum Ordnen und Klassifizieren hat der Mensch vergangene Epochen stets unter dem Gesichtspunkt herausragender gesellschaftlicher und kultureller Errungenschaften betrachtet. Begriffe wie „Eisenzeit“ oder „Neuzeit“ sind jedermann geläufig. Die fortschreitende Entwicklung der modernen Wissenschaften hat die letzten zwei Jahrhunderte vornehmlich geprägt. Stand das 19. Jahrhundert allgemein im Zeichen aufblühender Technik, bahnbrechender medizinischer Entdeckungen und der Emanzipierung der Naturwissenschaften, gehen wir kaum fehl, wenn wir das 20. Jahrhundert als das Atom- und Computerzeitalter bezeichnen.

Trotz der ungeheuren Leistungen, die auf den Gebieten der Physik und der Chemie vollbracht wurden, hat sich die Biologie in den Jahrzehnten seit 1953, als James Watson, Francis Crick und Maurice Wilkins die Desoxyribonukleinsäure (DNS) als Träger der genetischen Information entdeckten, unaufhaltsam eine Schlüsselposition erobert. Dass dem nicht immer so war, demonstriert die Tatsache, dass ein Nobelpreis für Biologie vom Stifter nicht vorgesehen war und merkwürdigerweise bis heute nicht ausgelobt wird. Dennoch konnte die „klassische“ Biologie dank ihrer engen Bindung an die Medizin und die zunehmende gegenseitige Durchdringung mit den anderen naturwissenschaftlichen Disziplinen zu dem avancieren, was man heute in Ermangelung klarer Abgrenzungskriterien als Biowissenschaften bezeichnet. Nicht wenige sehen deshalb mit dem 21. Jahrhundert das Zeitalter der Biotechnologie anbrechen.

Ob sich diese Vision bewahrheitet, soll dahingestellt bleiben. Kaum zu bestreiten ist hingegen die Tatsache, dass insbesondere der Zellbiologie in dem neuen wissenschaftlichen Gebäude mit seinen zahlreichen Räumlichkeiten eine fundamentale Bedeutung zukommt. Betrachten wir die zahlreichen biowissenschaftlichen Teildisziplinen genauer, stellen wir fest, dass die Beschäftigung mit Zellen darin eine mehr oder weniger zentrale Rolle spielt. Die Zell- und Gewebekultur bildet gewissermaßen die Basis, auf der die gesamte Biotechnologie aufbaut.

In der Tat sind in den letzten Jahrzehnten Zellkulturen zu einem der wichtigsten Werkzeuge in der zellbiologischen, virologischen und immunologischen Forschung sowie in der Tumorforschung geworden. Die enormen Fortschritte in der Grundlagenforschung, der Medizin und der Pharmazeutik wären ohne die Verwendung von Zellkulturen nicht möglich gewesen.

1.2 Die mühseligen Anfänge

Obwohl uns die Zellkultur als eine sehr moderne und mit großem technischen Aufwand betriebene Methode erscheint, reichen ihre Wurzeln weit zurück. Man macht sich kaum noch eine Vorstellung von den nahezu unüberwindlichen Schwierigkeiten und Hindernissen, mit denen sich die Pioniere seinerzeit konfrontiert sahen. Es dürfte nicht übertrieben sein, wenn man aufgrund der äußerst unzureichenden Voraussetzungen von einer Erfolgsquote von höchstens 1% ausgeht. Die großen Probleme bei dem Versuch Zellen lebend in Kultur zu halten, ließen ahnen wie komplex die Lebensvorgänge auf der mikroskopischen und auf der molekularen Ebene tatsächlich sind. Heute wissen wir um die Vielschichtigkeit der Ursachen, die im Laufe eines langwierigen Erkenntnisprozesses nach und nach mühsam und von zahlreichen Rückschlägen begleitet aufgedeckt wurden.

Jedes komplex organisierte Lebewesen – ob Mensch, Tier oder Pflanze – entsteht aus einer einzelnen Zelle, der befruchteten Keimzelle. Durch kontinuierliche Teilung und Differenzierung entwickelt sich ein komplizierter Organismus aus zahlreichen, miteinander in wechselseitiger Beziehung stehender Zellen. Ärzte und Wissenschaftler waren von Anfang an bestrebt, diesen Vorgang auch künstlich im Labor („in vitro“) durchführen und studieren zu können. Zum einen wollte man die Mechanismen der Krankheitsentstehung, zum anderen die entwicklungsbiologischen Vorgänge aufdecken und untersuchen. Die ersten „Zellkulturen“ beschaffte man sich mit dem Kescher aus einem Tümpel. Amphibienlaich – das weiß jeder, den der Forscherdrang in jungen Jahren mit dem Marmeladenglas voller Froscheier nach Hause trieb – verlangt außer genügend Wasser keine besonderen Vorkehrungen. Unendlich schwieriger erwiesen sich hingegen die lebenserhaltenden Maßnahmen bei frisch isolierten Zellen oder Gewebeproben! Selbst Krebszellen, deren Teilungsaktivität ungehemmt vonstatten geht, konnten in einer Kulturschale kaum am Leben erhalten werden.

Man muss sich vergegenwärtigen, dass nahezu alle heute bekannten Parameter der Zellphysiologie damals unbekannt waren. Über die Nährstoffe, die ein Mensch zum Leben braucht, lagen gesicherte Erkenntnisse vor. Welche Ansprüche jedoch eine Zelle hinsichtlich der Versorgung und der Darreichungsform stellen mochte, darüber herrschte größte Unsicherheit. Da einer Zelle kaum feste Kost zugemutet werden konnte und eine Kultur in wasserloser Umgebung in kurzer Zeit vertrocknet, versuchte man es zunächst mit so kuriosen Flüssigkeiten wie Boullion aus Rindfleisch. Die Rinderbrühe konnte sich in der Zellkultur jedoch nicht durchsetzen. In erstaunlicher Vorausahnung der tatsächlichen Gegebenheiten experimentierte man nun mit Blutflüssigkeit und Lymphe, um die Kulturbedingungen für Säugerzellen soweit wie möglich der natürlichen Situation anzupassen.

Während die Nährstofffrage zumindest vorläufig gelöst schien, sah man sich mit einem anderen, kaum weniger bedeutenden Problem konfrontiert: den allgegenwärtigen Mikroorganismen, die sich als lästige Kommensalen („Mitesser“) in fast allen Zellkulturen trotz sorgsamster Abschirmung erfolgreich einnisten konnten. Da eine schlagkräftige Abwehrstrategie in Form von Antibiotika noch nicht zur Verfügung stand, muss die Verlustrate außergewöhnlich hoch gewesen sein.

Verglichen mit den Schwierigkeiten bei der Bereitstellung von Nährstoffen und der Aufrechterhaltung steriler Bedingungen war die Versorgung der Kulturen mit Wärme in geeigneten Behältern eine durchaus lösbare Aufgabe. Die Temperatur wurde mittels Thermometer und Raumheizung auf dem erforderlichen Niveau gehalten. Ein einfacher Kasten, ausgestattet mit einer Schale Wasser und einer Kerze kann als Urahn aller Brutschränke betrachtet werden.

1.3 Die zukünftige Schlüsseltechnologie

Versuch und Irrtum bestimmten noch bis weit in die erste Hälfte des 20. Jahrhunderts die meisten Experimente mit Zellen. Erst die Entwicklung spezieller Kulturmedien und die Entdeckung der Antibiotika erlaubten den Zellforschern eine adäquate Nährstoffversorgung ihrer Zellkulturen sowie eine gezielte Bekämpfung mikrobieller Infektionen bzw. deren Vorbeugung. Die Zahl der erfolgreich in Kultur genommenen Zellen konnte ständig gesteigert werden. Infolge der rasanten Entwicklung auf dem Gebiet der Labortechnik und der immens verfeinerten Analysemethoden hat die Zellkultur mittlerweile einen Stand erreicht, der es erlaubt, komplexe Primär- und Gewebekulturen in vitro zu etablieren.

Besonders durch die stürmische Entwicklung der Biotechnologie gewann die Zellkultur, auch die pflanzliche Zell- und Gewebekultur, in der letzten Dekade des 20. Jahrhunderts ständig an Bedeutung. Konzentrierte sich das Interesse der Zellbiologen und Mediziner ursprünglich nur auf die Vorgänge in der einzelnen Zelle, untersucht man heute auch komplizierte Zusammenhänge in Zellverbänden und Geweben. Diese lassen sich meist nur in mehrschichtigen Cokulturen studieren, in denen z. B. sowohl Epithelzellen als auch Bestandteile ihrer natürlichen Umgebung (Basallamina, extrazelluläre Matrix, Fibroblasten) vorhanden sein müssen.

Schließlich sei noch darauf hingewiesen, dass die Zellkultur das Leiden von Tieren verringern hilft, indem sie Tierversuche überflüssig macht. Laut einer Statistik des Bundeslandwirtschaftsministeriums konnte die Zahl der Tierversuche in Deutschland von 1989 bis 1997 um mehr als 40% reduziert werden. Im Jahr 1996 wurden knapp 1,5 Mio Wirbeltiere in der Arzneimittelforschung „verbraucht“. Diese Zahl erscheint riesig, im Vergleich zur Situation vor 20 Jahren ist das jedoch eine Reduzierung um ca. 3 Mio Tiere pro Jahr. Es darf dennoch nicht verschwiegen werden, dass aufgrund der neuen EU-Chemikalienpolitik, die für Tausende von Stoffen neue toxikologische Untersuchungen vorsieht, seit Anfang der 1990 er Jahre die Zahl der Versuchstiere wieder auf mehr als 2 Mio pro Jahr angewachsen ist. Die Bedeutung der Zellkultur als Alternative zu Tierversuchen wächst dennoch ständig. So stellte die EU-Kommission im Jahr 2003 neue Arzneimitteltests auf der Basis von Zellkulturen vor, die preiswerter und genauer sein sollen als der herkömmliche Test an Kaninchen.

Die moderne Zellkultur hat die Kinderkrankheiten ihrer Anfangsphase weit hinter sich gelassen und ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug nicht nur für die Biologie und Medizin geworden. Zellkulturen werden zunehmend auch für technische Fragestellungen, z. B. in der Biotechnologie, Gentherapie oder in der Materialforschung eingesetzt. Sie werden sich auch in Zukunft weiterentwickeln und ein spannendes Betätigungsfeld nicht nur für Zellbiologen bleiben.

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Das Zellkulturlabor und seine Einrichtung

2.1 Was ist ein Laboratorium?

Wie jedes andere Gewerbe benötigt auch die praktische wissenschaftliche Tätigkeit einen geeigneten Arbeitsraum, ein Laboratorium oder Labor.

Unter einem Labor im Allgemeinen verstehen wir einen Raum, in dem von Fachleuten oder unterwiesenen Personen Arbeiten zur Erforschung und Nutzung medizinischer, naturwissenschaftlicher oder technischer Vorgänge durchgeführt werden.

Nicht selten wird das Labor auch zu Ausbildungszwecken genutzt. Den für den Umgang mit lebenden Zellen geeigneten Arbeitsbereich bezeichnen wir als Zellkulturlabor.

Als die Wissenschaftler ihr Labor noch im Straßenanzug mit Zylinder und Monokel betraten, gab es kaum Vorschriften darüber, wie ein Labor einzurichten sei. Inzwischen hat die Bürokratie eine Vielzahl an Normen, Rechtsvorschriften, technischen Regeln, Verordnungen, nationalen Gesetzen und EU-Richtlinien produziert, mit denen sich die Betreiber von Forschungsstätten bei der Ausstattung von Laboratorien befassen müssen. Die überwiegende Mehrheit des Laborpersonals wird kaum mit der Neueinrichtung eines Zellkulturlabors beauftragt werden und die rechtlichen Grundlagen in ihrem vollen Umfang würdigen können. Meist sind die Arbeitsbedingungen, unter denen Zellkultur betrieben werden soll, bereits vorgegeben. Dennoch sollten wir uns die wichtigsten Grundanforderungen an die Einrichtung eines Zellkulturlabors vergegenwärtigen, um gegebenenfalls Mängel erkennen und beseitigen zu können.

2.2 Allgemeine Ausstattung eines Zellkulturlabors

Wie wir noch sehen werden, erfordert die Arbeit mit Zellen zum Teil sehr unterschiedliche Laborstandards. Schon wenn wir uns in einer Forschungseinrichtung nach der Lage des Zellkulturlabors erkundigen, fällt auf, dass dieser Arbeitsbereich gewöhnlich nicht in ein molekularbiologisches oder genetisches Labor integriert ist. Meist werden wir einen separaten Raum vorfinden, der einen etwas abgeschotteten Eindruck auf den Besucher macht. Dieser Umstand ist kein Zeichen dafür, dass es sich bei den Zellbiologen um ausgesprochen eigenbrötlerische Naturen handelt. Die Gründe für die Lage des Zellkulturlabors, abseits der anderen Laborräume, liegen vielmehr in den besonderen Ansprüchen und Notwendigkeiten, die sich zwangsweise aus dem Umgang mit lebenden Zellen ergeben.

Zunächst muss der Laborraum genügend Bewegungsfreiheit, StellflächeGeräte sowie genug Stauraum für Verbrauchsmaterial bieten. Bei einem völlig mit Geräten zugestellten Labor und so engen Verkehrswegen, dass sich ein Mensch mit durchschnittlicher Körpergröße nur unter äußerster Anstrengung hindurchzuwinden vermag, versteht es sich von selbst, dass unter derartigen Verhältnissen viele Bestimmungen zur Arbeitssicherheit außer Kraft gesetzt sind. Hier kann es nicht ausbleiben, dass Arbeitsfreude und Motivation der Mitarbeiter auf der Strecke bleiben. Allen im Labor arbeitenden Personen sollte eine ausreichend bemessene Arbeits- und Verkehrsfläche zustehen. Die Bewegungsfläche (auch Bedienfläche genannt) vor einem Labortisch muss mindestens 0,45 m und die Verkehrsfläche (d. h. die Wege durch das Labor) mindestens 0,55 m Breite aufweisen (Abb. 2.1 a und b). Je nach Anzahl der im Labor arbeitenden Personen oder der Verteilung der Labormöblierung im Raum muss die Verkehrsfläche entsprechend großzügiger bemessen sein.

Darüber hinaus hat der Betreiber für ausreichend Flucht- und Rettungswege zu sorgen und diese eindeutig und dauerhaft kenntlich zu machen. Diese lebensrettenden Einrichtungen dürfen auf keinen Fall blockiert werden, zum Beispiel mit einer davor abgestellten 80 kg schweren Kohlendioxidflasche. Die Türen zum Laborbereich dürfen nur nach außen aufschlagen, da es ansonsten im Falle einer Havarie zu dem gefürchteten „Diskothekeneffekt“ (mehrere Flüchtende behindern sich gegenseitig und geraten in Panik) kommen könnte. Ferner müssen Sichtfenster in den Türfüllungen ungehinderten Ein- und Ausblick gewähren. Mitunter werden Laborunfälleich nur von den außen Vorübergehenden bemerkt. Es wäre also sträflich leichtsinnig, das Sichtfenster mit den Urlaubsgrüßen der Kolleginnen und Kollegen, Plakaten o. ä. zu verdecken. Bewusstlose oder verletzte Personen könnten im Ernstfall nicht rasch genug geborgen und versorgt werden.

Eine angenehme Arbeitsatmosphäre im Labor ist nicht überall eine Selbstverständlichkeit. Sowohl hohe Lufttemperaturen wie im Treibhaus als auch ähnlich niedrige Temperaturen wie im Iglu sind nicht selten anzutreffen und beeinträchtigen das Wohlbefinden und die Gesundheit der Betroffenen. Es trifft zwar zu, dass das Arbeiten im Tageslicht angenehmer ist als an einem fensterlosen Arbeitsplatzim Keller. Intensive Sonnenbestrahlung, vor allem im Sommer, sorgt jedoch zusammen mit der unvermeidlichen Abwärme zahlreicher elektrischer Geräte schnell für Temperaturen jenseits der 30 °C-Marke. Man halte nur die Hand über das Lampenhaus eines Mikroskops, um zu ahnen, wie viel elektrische Energie im Labor als „Wärmeabfall“ anfällt. In einem Labor, dass auf der gesamten Ost- und Südseite bis zur Decke reichende Panoramafenster, aber keine Klimaanlagetzt, wird der Vorsatz, stets mit Schutzkleidung zu arbeiten, auf eine harte Probe gestellt.

Da sich aus Gründen, die später noch Erwähnung finden werden, beim Arbeiten mit Zellkulturen das Öffnen der Fenster verbietet, sollten zumindest elektrisch betriebene Rollos oder Blenden vorhanden sein, die je nach Sonneneinstrahlung herabgelassen werden können. Sonnenblenden an der Fensteraußenseite sind übrigens weitaus effektiver, da sie die Sonnenstrahlen bereits vor der Fensterscheibe abweisen und somit einer Aufheizung vorbeugen. Innenrollos verdunkeln zwar den Raum, verhindern jedoch kaum den unerwünschten Temperaturanstieg. Technische Lüftungseinrichtungen einen achtfachen Luftwechsel pro Stunde erlauben, kombiniert mit einer Klimaanlage, bieten derzeit den höchsten Komfort. Allerdings muss dafür Sorge getragen werden, dass die Systeme einwandfrei eingeregelt und justiert sind, da ansonsten der gegenteilige Effekt auftritt. Unangenehm kalte Zugluft im Labor ist der Gesundheit ebenso unzuträglich wie Cabrio fahren im November.

Abb. 2.1 Doppelarbeitstisch mit großzügiger Verkehrsfläche.

Aus Großraumbüros ist bekannt, dass Lüftungs- und Klimaanlagen zu regelrechten Keimschleudern werden können. Da der Eintrag von Staub und somit auch von Keimen in ein Zellkulturlabor so gering wie möglich gehalten werden sollte, muss die zugeführte Luft einen Filter passieren, der die Kleinstpartikel erfolg...

Inhaltsverzeichnis

• Cover
• Inhaltsverzeichnis
• Title Page
• Copyright
• Dedication
• Vorwort
• 1 Geschichte und Bedeutung der Zellkultur
• 2 Das Zellkulturlabor und seine Einrichtung
• 3 Sicheres Arbeiten im Zellkulturlabor
• 4 Nährmedien für die Zellkultur
• 5 Routinemethoden in der Zellkultur etablierter Zelllinien
• 6 Umgang mit kontaminierten Zellkulturen
• 7 Spezielle Methoden in der Zellkultur
• Anhänge
• Sachverzeichnis